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PCR反應(yīng)的主要物質(zhì)解說
日期：2024-11-21 21:03
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摘要：參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+詳細解說：
1.引物
引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其設(shè)計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。
2.酶及其濃度
目前有兩種Taq DNA聚合酶，一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U(指總反應(yīng)體積為100ul時)，濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。
3.dNTP的...
參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+詳細解說：
1.引物
3.dNTP的質(zhì)量與濃度
dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴增效率有密切關(guān)系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當易變性失去生物學活性。dNTP溶液呈酸性，使用時應(yīng)配成高濃度后，以1M NaOH或1M Tris-HCL緩沖液將其pH值調(diào)節(jié)到7.0～7.5，小量分裝，-20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。
在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等(等摩爾配制)。當其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低)，就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。
4.模板(靶基因)核酸
模板核酸的量與純化程度是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理樣本。SDS的主要功能是：溶解細胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜，并解離細胞中的核蛋白，SDS還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀；
蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白，再用有機溶劑酚與lv 仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)。一般臨床檢測標本，可采用快速簡便的方法溶解細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。
5.Mg2+濃度
Mg2+對PCR擴增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響。在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴增；濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。
1.引物
引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其設(shè)計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。
2.酶及其濃度
目前有兩種Taq DNA聚合酶，一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U(指總反應(yīng)體積為100ul時)，濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。3.dNTP的質(zhì)量與濃度
dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴增效率有密切關(guān)系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當易變性失去生物學活性。dNTP溶液呈酸性，使用時應(yīng)配成高濃度后，以1M NaOH或1M Tris-HCL緩沖液將其pH值調(diào)節(jié)到7.0～7.5，小量分裝，-20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。
在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等(等摩爾配制)。當其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低)，就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。
4.模板(靶基因)核酸
模板核酸的量與純化程度是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理樣本。SDS的主要功能是：溶解細胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜，并解離細胞中的核蛋白，SDS還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀；
蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白，再用有機溶劑酚與lv 仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)。一般臨床檢測標本，可采用快速簡便的方法溶解細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。
5.Mg2+濃度
Mg2+對PCR擴增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響。在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴增；濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。