實(shí)時熒光定量PCR的十大不利操作說明

1、引物和探針設(shè)計不當(dāng)

為了*高效地設(shè)計用于實(shí)時熒光定量PCR的引物和探針，我們強(qiáng)烈建議您使用引物設(shè)計軟件。大多數(shù)引物設(shè)計程序均包含了可調(diào)節(jié)的參數(shù)以設(shè)計*佳的引物和探針。這些參數(shù)涉及了引物/探針的Tm值、互補(bǔ)性、二級結(jié)構(gòu)以及擴(kuò)增子大小等重要因素。另外還建議您限制連續(xù)的重復(fù)核酸數(shù)目。當(dāng)設(shè)計用于真核目標(biāo)序列的擴(kuò)增子時，請選擇在目標(biāo)mRNA中至少跨越一個外顯子-外顯子接合點(diǎn)的PCR引物對，以避免從殘留的基因組DNA模板擴(kuò)增目標(biāo)片段。

2、使用了低質(zhì)量的RNA

已降解的或低純度的RNA會抑制反轉(zhuǎn)錄效率并降低得率。所用的RNA應(yīng)當(dāng)來自于新鮮組織，或者經(jīng)過RNA穩(wěn)定試劑處理過的組織，如RNAlater短片段試劑（70–250 bp）等。這樣可以避免少部分降解RNA對結(jié)果的影響。若無法使用完全完整的RNA，則可以使設(shè)計的引物對與感興趣基因內(nèi)部區(qū)域進(jìn)行匹配。需要注意的是，對于真正的實(shí)時熒光定量PCR，部分降解的RNA可能無法給出基因表達(dá)的精que結(jié)果。

3、未使用“預(yù)混液”

qRT-PCR是一種分析RNA的高靈敏工具。由于PCR反應(yīng)會擴(kuò)增目的基因，所以誤差也會被同時擴(kuò)增出來。因此，無論何時都應(yīng)當(dāng)確保變異處于*低水平。“預(yù)混液”是反應(yīng)試劑的混合液，在設(shè)置建立多個反應(yīng)時應(yīng)當(dāng)使用它來*小化樣品間和反應(yīng)孔間的差異以提高可重復(fù)性。為了進(jìn)一步減少孔間差異，可以向預(yù)混液中加入ROX等參比熒光。

4、引入交叉污染

對PCR區(qū)域的所有表面均應(yīng)當(dāng)使用DNA去污染試劑來進(jìn)行日常去污染工作以防止交叉污染，推薦使用如DNAzap的試劑，其可以破壞DNA?？梢允褂谩盁o模板對照“（NTC）來排除試劑和實(shí)驗桌面的交叉污染。NTC含有除RNA模板外的所有RT-PCR試劑。通常是用無核酸酶水簡單地替換掉反應(yīng)中的RNA。反應(yīng)后NTC中應(yīng)當(dāng)沒有合成任何產(chǎn)物；若有產(chǎn)物被合成了，則意味著RT-PCR試劑中的一種或多種被擴(kuò)增產(chǎn)物污染了。

5、未使用“– RT”對照

在RNA制備過程中，事實(shí)上不可能完全去除基因組DNA。因此，在qRT-PCR實(shí)驗中有必要加入無逆轉(zhuǎn)錄酶對照（“非擴(kuò)增對照“，還可記為NAC）。通常，NAC是一個模擬的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，其中含有除逆轉(zhuǎn)錄酶之外的所有RT-PCR試劑。若在NAC中可觀察到產(chǎn)物，通常意味著樣品中殘留有DNA。

6、使用了不適當(dāng)?shù)木换瘜φ?

任意qRT-PCR實(shí)驗的可靠性均可以通過在實(shí)驗中引入一個不變的內(nèi)參對照得到改善，這樣做有助于改善qRT-PCR的樣品間差異以及樣品定量過程中的誤差。一個好的對照，其表達(dá)水平應(yīng)當(dāng)在所分析的樣品中保持不變。通常我們使用18S rRNA作為對照，因為它相比其他傳統(tǒng)內(nèi)參對照如?-actin或GAPDH等表達(dá)水平變化更小。

7、使用SYBR Green時未進(jìn)行熔解曲線分析

理想情況下，實(shí)驗樣品在擴(kuò)增子熔解溫度下會產(chǎn)生一個清晰的峰（一階導(dǎo)數(shù)圖），而NAC及NTC則不會產(chǎn)生任何明顯的熒光信號。這類結(jié)果意味著PCR產(chǎn)物是特異性的，且此時SYBR Green I 熒光是對目的產(chǎn)物的累積的直接測量。若熔解曲線顯示為一系列的峰，則意味著此時很難分辨出特異性及非特異性反應(yīng)產(chǎn)物。為了獲取有意義的數(shù)據(jù)，這種情況下必須對qRT-PCR進(jìn)行優(yōu)化。

8、沒有正確地設(shè)置基線和閾值線

為了得到精que的Ct值，應(yīng)當(dāng)在豐度*高的樣品所對應(yīng)Ct值兩個循環(huán)之前設(shè)置基線。為了使實(shí)時熒光定量PCR的數(shù)據(jù)有意義，應(yīng)當(dāng)在指數(shù)擴(kuò)增期設(shè)置閾值線。典型情況下，閾值應(yīng)當(dāng)設(shè)置在基線至少10個標(biāo)準(zhǔn)差范圍內(nèi)。

9、擴(kuò)增效率低

擴(kuò)增效率(Eff)可以通過以下公式進(jìn)行計算：

Eff = 10 (–1/slope) – 1

PCR的效率應(yīng)當(dāng)在90-110%之間（3.6 > 斜率 > 3.1）。有一系列變量會影響到PCR的效率。舉例來說，這些因素包括擴(kuò)增子的長度、二級結(jié)構(gòu)以及引物設(shè)計等。盡管擴(kuò)增效率落在上述范圍之外時，我們也可以得到有效數(shù)據(jù)，但是仍然應(yīng)當(dāng)對qRT-PCR進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化或改變擴(kuò)增子設(shè)計。

10、使用不正確的范圍來制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

在RNA定量研究（優(yōu)良或相對定量）中或驗證PCR（delta-delta-Ct）的擴(kuò)增效率時，對于每個基因都應(yīng)當(dāng)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)點(diǎn)應(yīng)當(dāng)覆蓋您的目標(biāo)基因期望豐度。額外的數(shù)據(jù)點(diǎn)也可以包括在內(nèi)，例如在極限上下方的*小及*大RNA量等，以幫助區(qū)分特異性和非特異性產(chǎn)物。