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影響ELISA實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)假陽性結(jié)果的操作因素
日期：2024-11-21 23:19
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摘要：影響ELISA實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)假陽性結(jié)果的操作因素
影響ELISA實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)假陽性結(jié)果的操作因素：
1、加樣
對(duì)于間接ELISA標(biāo)本一般都要進(jìn)行稀釋，如果加樣不準(zhǔn)就會(huì)造成誤差，尤其當(dāng)稀釋倍數(shù)大時(shí)，很小的誤差，會(huì)導(dǎo)致較大的相對(duì)誤差，使陰性（或弱陽性）標(biāo)本呈陽性（或陰性）。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。目前，大部分血站都已使用全自動(dòng)酶免加樣系統(tǒng)處理標(biāo)本，可較好地避免以上誤差。
2、洗滌
在ELISA中正確的洗滌是保證得到可重復(fù)結(jié)果的關(guān)健一步，應(yīng)引起操作者重視。無論是手工操作還是機(jī)器操作，得出不正確的結(jié)果常與不正確的洗滌有關(guān)，ELISA就是靠洗滌來達(dá)到分離游離和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。通過洗滌以消除殘留在板孔中沒能與固體抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。
3、 溫育
每種試劑都有其zui合適的反應(yīng)模式，其中溫度和溫育時(shí)間控制是重要因素。因孵育溫度高，反應(yīng)時(shí)間長，會(huì)造成整板本底高，陽性率高。溫育一般用濕盒或水浴，反應(yīng)板不宜疊放，以保證各板溫度都能迅速平衡，為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋。
4、酶標(biāo)儀判讀
作為記錄測定結(jié)果的儀器，酶標(biāo)儀的性能穩(wěn)定與否，決定結(jié)果的可靠度。首先酶標(biāo)儀應(yīng)定期進(jìn)行保養(yǎng)，對(duì)濾光片要定期校正；其次酶標(biāo)儀波長設(shè)置要正確，使用雙波長，一個(gè)檢測波長，一個(gè)參比波長，以消除微孔板底部劃痕、不平、指印或液面高度差異造成的光干擾。此外，在用酶標(biāo)儀讀數(shù)時(shí)先擦試微孔板底部并壓平板條。由于各種酶標(biāo)儀性能有所不同，使用中應(yīng)詳細(xì)閱讀說明書
綜上所述，由于酶聯(lián)免 疫吸附技術(shù)目前在技術(shù)上缺乏標(biāo)準(zhǔn)化，由于受方法學(xué)及技術(shù)條件的限制，在酶聯(lián)吸附測定中有時(shí)不可避免的會(huì)出現(xiàn)一定的非特異性，但我們可以通過以上措施把非特異性顯色降至zui低限底，從而提高檢測的特異性，并得到更準(zhǔn)確、可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
1、加樣
對(duì)于間接ELISA標(biāo)本一般都要進(jìn)行稀釋，如果加樣不準(zhǔn)就會(huì)造成誤差，尤其當(dāng)稀釋倍數(shù)大時(shí)，很小的誤差，會(huì)導(dǎo)致較大的相對(duì)誤差，使陰性（或弱陽性）標(biāo)本呈陽性（或陰性）。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。目前，大部分血站都已使用全自動(dòng)酶免加樣系統(tǒng)處理標(biāo)本，可較好地避免以上誤差。
2、洗滌
在ELISA中正確的洗滌是保證得到可重復(fù)結(jié)果的關(guān)健一步，應(yīng)引起操作者重視。無論是手工操作還是機(jī)器操作，得出不正確的結(jié)果常與不正確的洗滌有關(guān)，ELISA就是靠洗滌來達(dá)到分離游離和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。通過洗滌以消除殘留在板孔中沒能與固體抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。
3、 溫育
每種試劑都有其zui合適的反應(yīng)模式，其中溫度和溫育時(shí)間控制是重要因素。因孵育溫度高，反應(yīng)時(shí)間長，會(huì)造成整板本底高，陽性率高。溫育一般用濕盒或水浴，反應(yīng)板不宜疊放，以保證各板溫度都能迅速平衡，為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋。
4、酶標(biāo)儀判讀
作為記錄測定結(jié)果的儀器，酶標(biāo)儀的性能穩(wěn)定與否，決定結(jié)果的可靠度。首先酶標(biāo)儀應(yīng)定期進(jìn)行保養(yǎng)，對(duì)濾光片要定期校正；其次酶標(biāo)儀波長設(shè)置要正確，使用雙波長，一個(gè)檢測波長，一個(gè)參比波長，以消除微孔板底部劃痕、不平、指印或液面高度差異造成的光干擾。此外，在用酶標(biāo)儀讀數(shù)時(shí)先擦試微孔板底部并壓平板條。由于各種酶標(biāo)儀性能有所不同，使用中應(yīng)詳細(xì)閱讀說明書
綜上所述，由于酶聯(lián)免 疫吸附技術(shù)目前在技術(shù)上缺乏標(biāo)準(zhǔn)化，由于受方法學(xué)及技術(shù)條件的限制，在酶聯(lián)吸附測定中有時(shí)不可避免的會(huì)出現(xiàn)一定的非特異性，但我們可以通過以上措施把非特異性顯色降至zui低限底，從而提高檢測的特異性，并得到更準(zhǔn)確、可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。